Introdução

O advento de técnicas microcirúrgicas, em especial da microanastomose vascular, possibilitou a ampla utilização de enxertos arteriais e o extenso desenvolvimento de práticas cirúrgicas em diversas especialidades.¹

Cirurgiões plásticos usam retalhos livres microcirúrgicos para melhorar o fechamento de feridas complexas relacionadas a traumas, infecções, cirurgias oncológicas e deformidades congênitas. As técnicas clássicas ganharam notoriedade devido à sua versatilidade e bons resultados. De modo geral, o retalho anterolateral da coxa (ALT, do inglês anterolateral thigh)² é coletado do ramo descendente da artéria femoral circunflexa lateral, possibilitando a obtenção de um retalho fasciocutâneo ou miocutâneo do músculo vasto lateral.

Outra técnica clássica e versátil é o retalho ósseo do rádio, obtido do antebraço. Sua versatilidade inclui cirurgias de reconstrução peniana³ e craniofacial.⁴

Além disso, o retalho livre musculocutâneo transverso do reto abdominal (TRAM, do inglês transverse rectus abdominis musculocutaneous) e o retalho perfurante da artéria epigástrica inferior profunda (DIEP, do inglês deep inferior epigastric artery perforator) são usados para reconstrução mamária,⁵ sendo o último padrão-ouro para a reconstrução mamária com tecido autólogo.

Muitos outros retalhos foram descritos, cada um com suas especificidades e indicações. Há espaço para seu maior desenvolvimento, trazendo mais benefícios aos pacientes. No entanto, a trombose da anastomose ainda é a complicação mais grave. Devido à sua natureza multifatorial, o monitoramento contínuo e cuidadoso desses retalhos pelas equipes médicas é essencial, pois as consequências podem ser devastadoras, com influência significativa sobre a morbidade.^6,7 Nos casos em que a trombose de um retalho livre se torna irreversível, pode ser necessário explorar sítios doadores alternativos, o que pode levar a comprometimentos funcionais locais.

Um dos procedimentos cardíacos mais comuns é a cirurgia de revascularização do miocárdio, realizada por cirurgiões cardíacos. Atualmente, mais de 90% dos enxertos utilizados para revascularização do miocárdio são obtidos das artérias mamárias internas esquerdas. No entanto, outros pedículos vasculares também são usados, como a veia safena, além das artérias radial e mamária interna direita.⁸ A literatura acerca desse procedimento relata aumento da taxa de reoperação ao longo dos anos devido à degeneração inevitável do tecido enxertado.⁹ A taxa de reabordagem é de 5,11% em 6 anos¹⁰ e de 17,3% em 12 anos.⁹ Logo, é importante que a cirurgia comprometa o menor número possível de sítios doadores.

Cirurgiões vasculares realizam procedimentos para o tratamento de doenças vasculares periféricas para restabelecimento da circulação comprometida. A veia safena é comumente usada para desvio do fluxo sanguíneo de artérias obstruídas nos membros inferiores.¹¹ Os fatores de risco para o desenvolvimento dessas doenças estão associados ao estilo de vida e ao envelhecimento, aumentando o número de pacientes acometidos e, por conseguinte, a frequência de realização de cirurgias corretivas.¹² Com o tempo, os enxertos vasculares têm sido utilizados em outras áreas cirúrgicas, como a neurocirurgia.¹³

Com o aprimoramento técnico nas últimas décadas, o desenvolvimento de múltiplos retalhos livres permitiu o acesso a regiões anatômicas com pedículos longos.^14,15 Muitas vezes, algumas partes dos pedículos não são necessárias e são descartadas.

A microanostomose pode levar à trombose pós-operatória, exigindo um novo procedimento cirúrgico. Acreditamos que o excesso de pedículos descartados, especialmente os arteriais, pode ser colocado no tecido subcutâneo e, se necessário, utilizado como enxerto.

Ademais, a remoção de enxertos vasculares pode provocar complicações, como cicatrização da ferida, infecção, comprometimento da irrigação e drenagem dos tecidos, hematoma, dor e lesões nervosas.

A literatura relata a preservação subcutânea bem-sucedida de tecido autólogo, especialmente enxertos ósseos. A técnica demonstrou ser viável, com baixo custo, baixa taxa de infecção e com infiltrado mononuclear de aproximadamente 6% em um estudo com 50 pacientes,¹⁶ sendo mais satisfatória na preservação de tecido ósseo autólogo do que a criopreservação.¹⁷ O sucesso da criopreservação de enxertos vasculares também foi relatado,^18,19 mas o alto custo dessa técnica limita seu uso, principalmente em países em desenvolvimento. Outra técnica de preservação é o armazenamento a frio,²⁰ que pode ser realizado com glicerol²¹ e outras soluções, e vem sendo estudada por Alexis Carrel²² e outros desde 1910.

Acreditamos que é possível preservar o tecido vascular ao inseri-lo sob o tecido subcutâneo com boa taxa de sucesso, poucas complicações e baixo custo. Além disso, gostaríamos de avaliar se, em um banco de armazenamento, há diferença em termos de trombogenicidade ou degeneração tecidual entre enxertos arteriais com extremidades fechadas, devido a um ambiente intraluminal mais protegido, comparado a extremidades abertas.

Não encontramos informações sobre a criação de bancos de enxertos arteriais subcutâneos. Também não há estudos sobre a ocorrência de trombose, degeneração ou alterações inflamatórias relacionadas à inserção subcutânea desses enxertos, nem sobre a influência do armazenamento do vaso com extremidades abertas ou fechadas. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade da criação de um banco de enxertos arteriais subcutâneos autólogos para utilização posterior, assim como analisar a possível degeneração durante o período de acomodação.

Objetivo

Este estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de enxertos arteriais subcutâneos fechados e abertos para posterior anastomose. Também avaliamos o desenvolvimento de processos degenerativos e inflamatórios após a anastomose término-terminal do enxerto e comparamos as diferenças entre os resultados obtidos com enxertos subcutâneos com extremidades fechadas ou abertas.

Materiais e Métodos

O Comitê de Ética no Uso de Animais aprovou este estudo sob número 1327/2019.

Os procedimentos foram realizados pelo mesmo pesquisador, devidamente treinado, em 20 ratos Wistar com peso entre 180 e 220 gramas, entre 90 e 120 dias de idade.

Primeiro Procedimento Cirúrgico

Os animais foram submetidos à anestesia inalatória com isoflurano (1 mL/mL), utilizado tanto para indução quanto para manutenção da anestesia. Para a indução, os animais foram colocados em uma caixa específica e receberam um fluxo constante de oxigênio a 2 L/min e isoflurano (1 mL/mL) a 80 mL/min (equivalente a 4% do gás). Para manutenção da anestesia, o fluxo de oxigênio foi alterado para 700 mL/min e o fluxo de isoflurano (1 mL/mL) para 14 mL/min (equivalente a uma taxa de gás de 2%).

Tramadol (5 mg/kg), enrofloxacina (10 mg/kg) e cetoprofeno (5 mg/kg) foram administrados por via intramuscular. A enrofloxacina e o cetoprofeno foram administrados uma vez ao dia durante 3 dias, com a 1^a aplicação realizada no período intraoperatório.

Utilizando um microscópio cirúrgico com aumento de 10x, a dissecção começou na região cervical, isolando a artéria carótida externa (►Fig. 1). Posteriormente, obteve-se um enxerto de 9 mm desse vaso. Os ratos foram divididos aleatoriamente em 2 grupos: no 1° (grupo F, com 10 animais), o enxerto arterial foi fechado em suas extremidades distal e proximal com nylon 10-0 (►Fig. 2) e introduzido sob a pele da região inguinal. No segundo (grupo A, 10 animais, ►Fig. 3), o enxerto arterial foi introduzido sob a pele (►Fig. 4) sem oclusão das extremidades. Para introdução do enxerto, uma incisão de cerca de 15 mm foi feita na região inguinal, dissecando o tecido subcutâneo local e alocando o enxerto esticado sem tensão para posterior sutura cutânea. Não houve troca de enxerto entre os ratos.

Fig. 1 - Dissecção do enxerto da artéria carótida.

Fig. 1 - Dissecção do enxerto da artéria carótida.

Fig. 2 - Enxerto carotídeo fechado.

Fig. 2 - Enxerto carotídeo fechado.

Fig. 3 - Enxerto carotídeo aberto.

Fig. 3 - Enxerto carotídeo aberto.

Fig. 4 - Enxerto posicionado sob a pele.

Fig. 4 - Enxerto posicionado sob a pele.

Após a cirurgia, os ratos receberam água e comida ad libitum e permaneceram em repouso por sete dias com os enxertos alojados sob o tecido subcutâneo inguinal.

Segundo Procedimento Cirúrgico

Os animais foram submetidos à anestesia inalatória e ao tratamento analgésico, seguindo o mesmo procedimento.

O enxerto de 9 mm da artéria carótida externa foi removido cirurgicamente do tecido subcutâneo (►Fig. 5). Em seguida, suas extremidades foram submetidas à ressecção e interpostas por meio de uma anastomose término-terminal entre os cotos da artéria femoral (►Fig. 6). Para tanto, a artéria femoral foi dissecada e a adventícia removida no ponto escolhido para a anastomose, realizada a 10 mm de sua origem sob o ligamento inguinal. O fluxo sanguíneo foi obstruído com o auxílio de uma pinça microvascular e a artéria foi seccionada.

Fig. 5 - Enxerto removido do tecido subcutâneo após 1 semana.

Fig. 5 - Enxerto removido do tecido subcutâneo após 1 semana.

Fig. 6 - Enxerto carotídeo preparado para a anastomose na artéria femoral. Note a diferença de diâmetro entre o enxerto carotídeo e a artéria femoral.

Fig. 6 - Enxerto carotídeo preparado para a anastomose na artéria femoral. Note a diferença de diâmetro entre o enxerto carotídeo e a artéria femoral.

Cada anastomose, distal e proximal, foi realizada com 12 pontos simples separados, utilizando nylon 10-0 e agulha cilíndrica. Durante o procedimento, foi utilizado um microscópio (DF Vasconcelos) com aumento óptico de 25 a 40x.

A permeabilidade do enxerto foi constantemente monitorada nos primeiros 20 minutos após anastomose. Para isso, foram realizados pulsação e o “teste do leite” (milk test), que consiste em constrição do vaso com duas pinças de microcirurgia e sua separação, de forma que um segmento do vaso, distal ao enxerto anastomosado, fique sem sangue. Em seguida, a pinça proximal é liberada e o fluxo sanguíneo é restabelecido. Nos casos em que o enxerto não apresentou pulsação e não houve retorno sanguíneo após o “teste do leite”, o resultado foi considerado negativo, com ausência de permeabilidade, sugestiva de trombose.

Após a anastomose do enxerto, os ratos foram mantidos em gaiolas separadas, com temperatura e luminosidade controladas. Os animais receberam dipirona sódica (100 mg/kg) por via subcutânea a cada 6 horas durante as 24 horas seguintes, além de água e ração ad libitum.

Teste de Permeabilidade e Eutanásia

Após 24 horas da anastomose do enxerto, os ratos foram novamente submetidos à anestesia inalatória, como já descrito, e a permeabilidade da artéria enxertada foi avaliada quanto à coloração, pulsação e “teste do leite”. Nos casos em que o enxerto não apresentou coloração vermelho-claro, pulsação e ausência de retorno sanguíneo ao “teste do leite”, a permeabilidade foi considerada ausente, sugerindo trombose (►Fig. 7). Nos casos com coloração vermelho-claro, pulsação e “teste do leite” positivo, o enxerto foi considerado pérvio (►Fig. 8).

Fig. 7 - Enxerto trombosado após 24 horas.

Fig. 7 - Enxerto trombosado após 24 horas.

Fig. 8 - Enxerto pérvio após 24 horas.

Fig. 8 - Enxerto pérvio após 24 horas.

A eutanásia foi realizada com uma superdosagem de 120 mg/kg de tiopental intravenoso imediatamente após o teste de permeabilidade.

Análise Histológica

Os enxertos e anastomoses foram seccionados em formato retangular (►Fig. 9), fixados em solução de formol a 10% por 24 horas e embebidos em parafina. Em seguida, cortes longitudinais de 5 μm foram obtidos e corados com solução de hematoxilina e eosina (HE) para avaliação histopatológica com cegamento dos pesquisadores. As lâminas foram analisadas e os espécimes avaliados quanto a alterações histológicas (integridade da camada muscular média e infiltrado inflamatório), de acordo com a International Harmonization of Nomenclature and Diagnostic Criteria for Lesions in Rats and Mice.²³ Os achados dos grupos experimentais foram comparados a lâminas de artéria femoral retiradas dos membros não operados dos ratos 19 e 20 após a eutanásia. A incidência das alterações identificadas (em %) foi calculada para cada intervenção.

Fig. 9 - Amostra de enxerto seccionado para análise histológica.

Fig. 9 - Amostra de enxerto seccionado para análise histológica.

Resultados

Os ratos foram numerados e aleatoriamente designados por sorteio cego entre os grupos “aberto” (A) e “fechado” (F), que tiveram a seguinte composição:

A ►Tabela 1 traz informações sobre a permeabilidade do enxerto em cada rato imediatamente, nos primeiros 20 minutos, e 24 horas após a conclusão da anastomose.

Tabela 1 - Informações de ratos individuais

Análise Histológica

A análise histopatológica demonstrou que todas as amostras de enxerto dos grupos aberto e fechado (100%) apresentaram degeneração da íntima e média, representada por: perda de detalhes nucleares e fragmentação de células endoteliais e musculares lisas (►Figs. 10–12).

Fig. 10 - Enxerto pérvio do grupo aberto após 24 horas.

Fig. 10 - Enxerto pérvio do grupo aberto após 24 horas.

Fig. 11 - Enxerto trombosado do grupo aberto após 24 horas.

Fig. 11 - Enxerto trombosado do grupo aberto após 24 horas.

Fig. 12 - Enxerto trombosado do grupo fechado após 24 horas.

Fig. 12 - Enxerto trombosado do grupo fechado após 24 horas.

A análise também mostrou que todas as amostras de enxerto dos grupos aberto e fechado (100%) apresentaram reação de corpo estranho,²⁴ nesse caso infiltrado inflamatório mononuclear, apenas nas linhas anastomóticas.

Nenhuma das amostras de enxerto dos grupos aberto ou fechado (0%) apresentou hipertrofia endotelial, ou infiltração inflamatória íntima ou na camada média do enxerto (►Figs. 10–12).

Estes achados também foram observados no enxerto de número 5 (►Fig. 10), que era pérvio 24 horas após a anastomose.

A avaliação das lâminas controles (►Fig. 13) mostrou que a camada íntima não tinha evidências de degeneração endotelial, perda de detalhes nucleares e hiperplasia. Além disso, a camada média não apresentava evidências de degeneração, sem fragmentação de células musculares lisas nem perda de detalhes nucleares.

Fig. 13 - Artéria femoral controle.

Fig. 13 - Artéria femoral controle.

Discussão

Estudos demonstraram que a capacidade de endotelização do enxerto vascular está relacionada à trombose, consistindo no crescimento da neoíntima sobre a parede interna do enxerto,^25,26 próximo à anastomose. Além disso, a repopulação da camada média com novas células musculares também foi documentada,^27,28 aumentando a funcionalidade do enxerto nos primeiros meses após o procedimento. Nossos achados indicam que o mesmo processo pode ocorrer em enxertos autólogos subcutâneos, com a vantagem de serem menos imunogênicos do que os não autólogos.^28,29 Mais estudos são necessários para avaliar essas possibilidades.

Estudos também mostraram que o método de preservação com glicerol faz com que as células da íntima e da média se tornem inviáveis. No entanto, a matriz extracelular é composta por colágeno III, elastina, proteoglicanos e glicoproteínas, sendo responsável por uma parte importante da estrutura arterial.^24,30 Assim, não há comprometimento da integridade funcional do enxerto arterial. Nossa análise histológica mostrou que as células musculares da camada média apresentavam núcleos sombreados, indicando que eram inviáveis e que as células endoteliais apresentam menor coesão entre si e núcleos desintegrados (►Figs. 10–12). Apesardisso, não houve casos de ruptura do enxerto, sugerindo a manutenção da capacidade funcional da artéria.

Em nossa avaliação, o infiltrado inflamatório mononuclear estava presente apenas na linha anastomótica,²⁴ o que era esperado devido à reação de corpo estranho.

Infelizmente, após 24 horas, a permeabilidade foi de apenas 10% no grupo aberto e nula no grupo fechado. No entanto, o único caso de sucesso (►Fig. 8) reforçou a viabilidade do método. Acreditamos que, no caso de anomalias histológicas relacionadas ao método de armazenamento, todos os enxertos teriam falhado e não permitiriam os 90% de permeabilidade no grupo A e 80% no F nos primeiros 20 minutos após a anastomose. Atribuímos a baixa taxa de permeabilidade final a aspectos do modelo animal utilizado e à ausência de tratamento profilático trombótico pós-cirúrgico. O diâmetro total do enxerto carotídeo foi significativamente maior em comparação ao da artéria femoral (►Fig. 6) e nenhum tratamento antiplaquetário ou anticoagulante³¹ foi administrado.

A literatura relata taxas variadas de permeabilidade em microanastomoses de artérias femorais em ratos Wistar.³²

Além disso, a utilização de coelhos como modelo animal pode ser válida em estudos futuros.

A baixa taxa de permeabilidade não deve diminuir os achados histológicos, que sugerem a viabilidade de um banco de enxertos arteriais autólogos subcutâneo. Essa técnica tem execução simples, baixo custo e baixa taxa de infecção, podendo aumentar a eficácia dos enxertos arteriais e reduzir a necessidade de maior exploração vascular.

Estudos futuros com análises histológicas mais detalhadas, incluindo cortes transversais de enxertos arteriais, poderiam avaliar simultaneamente as três camadas de tecido arterial. Técnicas de coloração específicas podem ser empregadas para análise da estrutura elástica dos enxertos. Além disso, um período de recuperação maior permitiria a avaliação da formação de neoíntima, da possibilidade de estenose e do processo de repopulação.

O presente projeto é inovador e pioneiro. Nenhum estudo avaliou a possibilidade de criação de bancos de enxertos arteriais autólogos subcutâneos. Devido à sua novidade e grande dificuldade técnica, não se esperava um grande percentual de permeabilidade nos enxertos arteriais era esperada.

Todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo pesquisador treinado usando a mesma técnica.

Uma porcentagem maior de anastomoses pode apresentar permeabilidade com a implementação de adaptações metodológicas. A permeabilidade do enxerto do rato número 5 nos incentiva a manter nossa linha de pesquisa e investir mais tempo e estudos nessa nova técnica, que pode beneficiar pacientes se aprimorada.

O modelo animal e a terapia antiplaquetária ou anticoagulante pós-operatória podem ser aprimorados e ter papel importante nos resultados de permeabilidade do enxerto. A análise histológica pode ter como alvo a matriz extracelular, responsável por manter a funcionalidade do enxerto arterial. Os achados de modelos animais devem ser interpretados com cautela quando extrapolados para uso clínico.

Conclusão

Depois do experimento, todas as amostras de enxerto dos grupos A e F apresentaram perda dos núcleos de células musculares lisas e redução da coesão entre as células endoteliais. Não houve diferença estatística entre os grupos em termos de permeabilidade imediata e tardia.

As alterações histológicas presentes parecem ser semelhantes às observadas em outras técnicas utilizadas para preservação de enxertos arteriais. O presente estudo piloto descreveu um método novo, promissor e de baixo custo, sem casos de infecção.